DISKOVÝ DIFÚZNÍ TEST - stanovení citlivosti bakteriálního kmene k antibiotikům.

Vysvětlení: Diskový test je standardní metoda pro stanovení citlivosti kmene k antibiotiku. Výsledek je: citlivý nebo rezistentní, podle toho, je-li průměr inhibiční zóny kolem disku na tuhé půdě alespoň stejný, nebo naopak menší, než stanovená hranice. Je to metoda kvalitativní, nejde o měření stupně citlivosti:

Zjišťuje se, zda citlivost kmene odpovídá alespoň break-pointu (hraniční koncentraci, t.j. léčebně účinné, v organizmu pacienta dosažitelné koncentraci antibiotika). Menší průměr inhibiční zóny signalizuje, že podávání tohoto antibiotika by bylo neúčinné - kmen je rezistentní. Průměry inhibičních zón odpovídajících break-pointům jednotlivých skupin antibiotik a bakterií jsou standardizovány ve formě tabulek, např. NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards).

Testování citlivosti je nezbytné, protože bakterie mohou rezistenci nově získat		mutací
		konjugací
		trandukcí
		transformací
Zdroj videoklipů: film Confronting Antibiotic Resistance: An Increasing Threat of Public Health. (1996) USA, Tufts University School of Medicine.

Teorie difúzního testu: Antibiotikum difunduje z disku položeného na povrch naočkované agarové půdy. Přítomné bakterie se množí, poblíž disku se časem v důsledku přílivu antibiotika a podle stupně své citlivosti množit přestávají . V určitém okamžiku a v určité vzdálenosti od disku však antibiotikum již nedokáže množení bakterií zastavit a ani pokračující příliv antibiotika mezitím narostlou bakteriální populaci již neohrozí: Zakládá se okraj inhibiční zóny, který se později ozřejmí dalším růstem bakterií. (Koncentrace antibiotika na okraji právě vznikající inhibiční zóny se jmenuje kritická koncentrace; pojem nemá klinický význam.)

Na velikost zóny má vliv citlivost kmene, fyzikální vlastnosti antibiotika a půdy, tloušťka půdy, rychlost množení kmene. Čím se kmen množí pomaleji, tím je zóna při stejné citlivosti kmene větší. Je zřejmé, že nelze stanovit univerzální hraniční průměry inhibičních zón pro jednotlivá antibiotika. 

Chyby:  Zjištěná citlivost je arteficiálně vyšší, je-li agarová půda příliš tenká, event. má-li kmen sníženou růstovou rychlost, došlo-li k tzv. predifuzi antibiotika při pozdním vložení misek do termostatu nebo při jejich pomalém prohřívání (přeplněný termostat), či bylo-li řídké bakteriální inokulum. Kmen se naopak zdá být rezistentnější, je-li použitý disk exspirován, je-li půda příliš tlustá, event. je-li použito příliš husté inokulum. Rovněž nestandardní složení půdy ovlivňující difúzi antibiotika může výsledek ovlivnit.  Podmínky (disky, půdy) je tak nutno pravidelně testovat pomocí referenčních kmenů o známé citlivosti.

Proč nelze tuto diskovou metodu použít k měření stupně citlivosti kmen? Teoreticky by to možné bylo, ale jen za přísně standardních podmínek, které v praxi obvykle nelze dodržet.

Provedení:

		Několik kolonií zkoumaného kmene se přenese kličkou ...
		... do fyziologického roztoku. Denzita suspenze se upraví srovnáním s kalibračními zákalovými standardy (0,5 Mc Farlanda).
		Suspenze se naočkuje sterilním tampónem, tak aby byl povrch kultivačního media (Mueller-Hintonův agar o tloušťce 4 mm) rovnoměrně pokryt.  Očkovat lze i strojkem:
		Ke stanovení citlivosti se používají standardní disky obsahující smluvená množství antibiotika.
		Disky se na povrch naočkované půdy kladou aplikátorem.
		Po zorientování dispenzor stiskneme.
		Výsledkem jsou rovnoměrně rozložené disky. Plotna je ihned umístěna v termostatu na 18hodin
		Po inkubaci se měří průměr inhibičních zón. Výsledek se porovná s tabulkou NCCLS a tak se zjistí, zda kmen je na antibiotikum citlivý nebo rezistentní. Měřit lze i strojem:
		Laboratorní automatické informační systémy interpretaci výsledku dle NCCLS provádějí autonomně.