Stanovení protilátek v séru reakcí ELISA

Jednou z možností průkazu protilátek je ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assay. Specifický antigen vyvolavatele je z výroby navázán na stěně mikrotitrační destičky v diagnostické soupravě. Do destičky se přidává vyšetřované sérum pacienta. Po inkubaci, kdy se prokazované protilátky zachytily na antigenu, se přidá konjugát - protilátka proti Fc fragmentu lidského imunoglobulinu IgM nebo IgG značená molekulou peroxidázy. Ten se váže na hledanou  protilátku pacienta (je-li přítomna). Následkuje promytí a přidání peroxidu a chromogenu (tetrametylbenzidinu) Je-li vyšetření pozitivní, chromogen  oxiduje na barevný produktu. Viz schema dole na této stránce. 

Aby se nemuselo čekat, až bude dost vzorků pro ekonomické využití celé 96 jamkové destičky, prodávají výrobci tzv. stripy - proužky po 8 jamkách. Ještě ekonomičtější provoz mají automatické analyzátory využívající plastové kyvety pro jeden vzorek. Antigen je zde vázán na magnetických mikročásticích, které jsou do kyvety  přidány až během reakce a uvnitř přidržovány vnějším magnetem. 

Postup:

ikona   Vhodně naředěné vyšetřované sérum (např. 1:100) pipetujeme do jamek mikrotitrační destičky.  Dochází k vazbě protilátek v séru na antigen navázaný na stěně mikrotitrační destičky. Do zvláštních jamek pipetujeme negativní a pozitivní kontrolní sérum dodávané se soupravou. ikona
ikona Inkubace v termostatu zajistí řádné proběhnutí reakce.ikona
ikona   Po promytí následuje přidání protilátky značené peroxidázou, tzv. konjugátu. Konjugát se váže na pacientovy protilátky jejich prostřednictvím je fixován ke stěně jamky.ikona
ikona Promytí v automatické promývačce zajistí dokonalé odstranění všech látek, které nejsou vázány na stěně mikrotitrační destičky.ikona
ikona   Příprava a rozplnění enzymového substrátu s chromogenem (H2O2 + tetrametylbenzidin). Ten je v pozitivním případě měněn za vzniku modrého zabarvení. Inkubace probíhá při pokojové teplotě v temnu. Reakci zastavíme přidáním H2SO4 a modrý produkt se změní ve stabilní žlutý. (Srv. ukázku u průkazu amplikonů analogickou hybridizační ELISOU při genetickém průkazu původce.)ikona
ikona   Hodnocení výsledku se provádí měřením optické denzity (OD) při vlnové délce chromogenu 450 nm. 
Optická denzita (OD) v jamce s firemním kontrolním sérem, která vymezuje rozhraní negativity od pozitivity  se jmenuje cut-off (C.O.). Měřené vzorky sér s OD < cut-off jsou interpretovány jako negativní, OD mírně nad cut-off značí neurčitý výsledek či "reaktivní vzorek" (vyšetření pacienta se zopakuje), OD zjevně nad cut-off značí pozitivitu. Podrobnosti jsou vždy v návodu ke konkrétní soupravě.ikona
Má-li být výsledek vyšetření kvantifikován, použije se kalibrační křivka získaná měřením OD dvou v soupravě dodávaných kontrolních sér, nízce a vysoce pozitivního. Výrobce v tom případě zaručuje stálost poměru OD/ množství protilátek. Nebo lze výsledek (orientačně) kvantifikovat podle logaritmu OD/cut-off. Semikvantitativním hodnocením mohou být slabě pozitivní vzorky označeny jedním křížkem (+), silně pozitivní třemi křížky (+++).  

Během onemocnění se charakter protilátkové odpovědi. Pevnost vazby vznikajících protilátek s antigenem je možno vyjádřit aviditou. která se zvyšuje. Aviditu lze sledovat pokusnou destabilizací komplexu antigen - protilátka přidáním močoviny a následným promytím. Čím více se po přidání močoviny OD sníží, tím je avidita nalezených protilátek menší a tím může být infekce čerstvější. Používá se omezeně.

ikona Záběry pořízeny v diagnostické laboratoři Vidia Diagnostika, Praha

 

Stanovení antigenu v krvi nebo jiném tekutém materiálu metodou ELISA.

Postup je zde analogický, jako u výše uvedeného průkazu protilátek, ale obrácený. Místo antigenu je na stěnu jamky v mikrotitrační destičce výrobcem vázána protilátka proti hledanému antigenu. Ta antigen ze vzorku zachytí. Antigen pak reaguje s následně přidanou značenou protilátkou. Takto se stanovují například antigeny některých hepatotropních virů. Při metodě Quantiferon slouží ELISA ke stanovení in vitro uvolněného interferonu. 

 

   Schémata ELISA. Posun vpřed a vzad klikáním na ikony tlačítky myši. 
ikona Jednotlivé kroky průkazu protilátek metodou ELISA.
ikona Soubor animací jednotlivých kroků průkazu protilátek metodou ELISA.

1. Protilátky, jsou-li přítomny, se specificky vážou na antigen. 2. promytím se odstraní nenavázané jiné protilátky. 3. konjugát reaguje s konstantní částí imunoglobulinu; obsahuje enzym. 4. promytím se nenavázaný konjugát odstraní. 5. je přidán substrát. 6. substrát je enzymem měněn za změny barvy.

biorad
ikona Jednotlivé kroky průkazu antigenu metodou ELISA.