Průkaz amplifikačního produktu hybridizací.

Hybridizačním průkazem se rozumí záchyt amplikonů pomocí specifické sondy (proby), která je fixována na dně detekční jamky. Následná detekce zachycených amplikonů se provádí pomocí barevné reakce analogické serologické reakci ELISA. 

Jinde popisované zpracování amplifikačního produktu elektroforézou je jednoduché, ale méně citlivé. Specifičtější a citlivější je zde popisovaná barevná reakce analogická serologické metodě ELISA. Na dně jamky je (místo protilátky) navázána záchytná sonda pro prokazovaný amplikon. Barevnou změnu  umožňuje značení použitých primerů např. biotinem, který je později využit pro vazbu enzymu. Jde o typickou ukázku komerční soupravy ROCHE pro PCR z 90.let, test na přítomnost Chlamydia trachomatis. Výhodou je možnost dalšího zpřesnění reakce specifickou záchytnou sondou.

Ukázka zahrnuje celé stanovení genomu původce včetně izolace DNA, amplifikace a detekce. Práce probíhá ve 3 oddělených pracovních prostorách, aby se předešlo kontaminaci vzorků amplikony.

 

ikona V oddělené místnosti je předem připraven master mix (obsahuje fosforylované nukleotidy A, T, C, G; polymerázu, pufr, primery) a naplněny amplifikační kyvety.ikona
ikona Přidáním lyzačního roztoku k vyšetřovanému vzorku je uvolněna DNA. Přenášení vzorku do amplifikačních kyvet. Pipetování kontrolních vzorků. Zavíčkování kyvet.ikona
ikona Vložení kyvet do cykleru a spuštění programu.Otevření kyvet po amplifikaci. Přidání NaOH (alkalická denaturace - oddělení obou řetězců amplikonů, aby mohly reagovat se záchytnou sondou).ikona
ikona Přenesení obsahu amplifikačních kyvet do mikrotitrační destičky, které obsahují záchytné sondy. Inkubace destičky. Dochází k záchytu amplikonů na dně jamek. Promytí destičky od nezachyceného materiálu.ikona
ikona Přidání substrátu pro barevnou reakci (viz serologie, ELISA). Reakce probíhá v temnu. Zastavení barevné reakce pomocí H2SO4. Měření OD fotometrem. Zvýšená OD svědčí pro přítomnost amplikonů.ikona
ikona Záběry pocházejí z filmu Roche Diagnostic Systems