Diluční metoda.
Diluční metoda se užívá ke stanovení minimální inhibiční koncentrace (MIC), nebo minimální baktericidní koncentrace (MBK). Metoda je kvantitativní, lze ji plně automatizovat a standardizovat.
Antibiotika jsou ředěna geometrickou řadou ( 0,125; 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 8…)
Základní pojmy:
MIC = nejnižší koncentrace antibiotika, která již inhibuje viditelný růst; udává se v
mg/ml nebo mg/l |
Diluční metoda v agaru.
Testování vybraných kmenů se provádí na Mueller-Hintonově agaru s definovanou koncentarcí iontů; každá plotna osahuje příslušnou koncentaraci testovaného antibiotika. Výška agaru je 4mm, pH je 7,4. Pro testování sterptokoků, pneumokoků je nutné přidat 5% defibrinovaných beraních erytrocytů do média. Inokulum testovaného kmene musí být 104 CFU, což odpovídá standardu 0,5McFarlanda. Jednotlivé plotny jsou naočkovány speciálním inokulátorem, na jedné plotně může být otestováno až 36 různých kmenů. Po naočkování se plotny inkubují při doporučené teplotě stanovenou dobu ( nejčastěji 18 -20hod při 35°C). Současně s testovanými kmeny je nutné provést test citlivosti i pro daný referenční kmen, jehož hodnota MIC je známá.
Hodnocení: MIC jednotlivých kmenů je nejnižší koncentrace antibiotika, která inhibuje viditelný růst na plotně.
Výhody:
Metoda je referenční pro ostatní systémy, lze otestovat najednou vetší počet kmenů k danému antibiotiku.
Nevýhody:
Náročnější na provedení, nepraktické pro rutinní provoz.
Diluční metoda v bujonu.
Dvě možnosti provedení - makrodiluční metoda ve zkumavkách s testovaným objemem větším než 1ml, nebo mikrodiluční metoda prováděná v mikrotitračních destičkách s objemem 0,1ml. Jako růstové médium se užívá Mueller - Hintonův bujón. Pro snadnější přípravu a provedení je široce rozšířená metoda mikrodiluční.
Koncentrace inokula opět odpovídá 0,5 stupnice McFarlanda, destička se naočkuje jehlovým inokulátorem a inkubuje za standardních podmínek.
Hodnocení: |
Výhody:
Touto metodou lze otestovat jeden kmen současně k více antibiotikům. Dle uspořádání až k 12 různým antibiotikům na jedné destičce.
Nevýhody:
Špatně lze hodnotit případnou bakteriální kontaminaci.
Stanovení MBK:
Zkumavky / mikrotitrační jamky s čirým bujónem se vyočkují na pevné půdy bez přídavku antibiotika a inkubují se. Ze zkumavek s bakteriostatickou koncentrací vyrůstají kolonie přežívajícího inokula. Poslední zkumavka / jamka bez nárustu kolonií na agaru udává MBC.
Provedení mikrodiluční metody