Diluční metoda.

Diluční metoda se užívá ke stanovení minimální inhibiční koncentrace (MIC), nebo minimální baktericidní koncentrace (MBK). Metoda je kvantitativní, lze ji plně automatizovat a standardizovat.
Antibiotika jsou ředěna geometrickou řadou ( 0,125; 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 8…)

Základní pojmy:

MIC = nejnižší koncentrace antibiotika, která již inhibuje viditelný růst; udává se v mg/ml nebo mg/l
MBK = nejnižší koncentrace antibiotika, která inhibuje růst 99,9% populace mikroorganismů; udává se v ml/mg nebo mg/l.
Platí, že MBK může být stejná nebo vyšší než MIC, nemůže být nižší.

Diluční metoda v agaru.

Testování vybraných kmenů se provádí na Mueller-Hintonově agaru s definovanou koncentarcí iontů; každá plotna osahuje příslušnou koncentaraci testovaného antibiotika. Výška agaru je 4mm, pH je 7,4. Pro testování sterptokoků, pneumokoků je nutné přidat 5% defibrinovaných beraních erytrocytů do média. Inokulum testovaného kmene musí být 104 CFU, což odpovídá standardu 0,5McFarlanda. Jednotlivé plotny jsou naočkovány speciálním inokulátorem, na jedné plotně může být otestováno až 36 různých kmenů. Po naočkování se plotny inkubují při doporučené teplotě stanovenou dobu ( nejčastěji 18 -20hod při 35°C). Současně s testovanými kmeny je nutné provést test citlivosti i pro daný referenční kmen, jehož hodnota MIC je známá. 
Hodnocení: MIC jednotlivých kmenů je nejnižší koncentrace antibiotika, která inhibuje viditelný růst na plotně.
Výhody:
Metoda je referenční pro ostatní systémy, lze otestovat najednou vetší počet kmenů k danému antibiotiku.
Nevýhody:
Náročnější na provedení, nepraktické pro rutinní provoz.


Diluční metoda v bujonu.


Dvě možnosti provedení - makrodiluční metoda ve zkumavkách s testovaným objemem větším než 1ml, nebo mikrodiluční metoda prováděná v mikrotitračních destičkách s objemem 0,1ml. Jako růstové médium se užívá Mueller - Hintonův bujón. Pro snadnější přípravu a provedení je široce rozšířená metoda mikrodiluční. 
Koncentrace inokula opět odpovídá 0,5 stupnice McFarlanda, destička se naočkuje jehlovým inokulátorem a inkubuje za standardních podmínek. 

Hodnocení:
MIC testovaného kmene je nejnižší koncentrace antibiotika, která inhibuje viditelný růst (zákal) v mikrotitrační jamce ( první čirá jamka).

Výhody:
Touto metodou lze otestovat jeden kmen současně k více antibiotikům. Dle uspořádání až k 12 různým antibiotikům na jedné destičce.
Nevýhody:
Špatně lze hodnotit případnou bakteriální kontaminaci.

Stanovení MBK:
Zkumavky / mikrotitrační jamky s čirým bujónem se vyočkují na pevné půdy bez přídavku antibiotika a inkubují se. Ze zkumavek s bakteriostatickou koncentrací vyrůstají kolonie přežívajícího inokula. Poslední zkumavka / jamka bez nárustu kolonií na agaru udává MBC.

Provedení mikrodiluční metody

ikona   Plnění mikrotitračních destiček antibiotiky. Připraví se zásobní roztoky pro všechny jamky v destičce (MH bujón a různými koncentracemi jednotlivých antibiotik). Těmi pak stroj destičky plní. V krátké době lze naplnit velké množství destiček, které se skladují ve zmraženém stavu. Jsou i prodávány.
ikona Manuální provedení mikrodiluční metody. V této ukázce je kmen testován ke 24 antibiotikům (na dvou destičkách). Inokulum je připraveno z jedné kličky kultury kmene na tuhé půdě ve vyzkoušeném objemu fyziologického roztoku. Inokulační nástroj je sterilizován smočením v etanolu a jeho zapálením. Naočkované destičky se inkubují 16-24 hodin při 37 °C.  
ikona   Nástroj k ruční inokulaci mikrotitračních destiček.
ikonaikona Odečítání výsledků vyšetření zvětšovacím zrcadlem. PIP - piperacilin, PPT - Piperacilin + tazocin, CPR - Cefoperazon, CTX - Cefotaxim, CTZ - Ceftazidim, CPM - Cefpiron, CPS - Cefoperazon + sulbaktam, MER - Meronem, CIP - Ciprofloxacin, LEV - Levofloxacin, TOB - Tobramicin, AMI - Amikacin. V popsané variantě obrázku (pravá část ikony) čísla znázorňují koncentraci antibiotika v jamce (mg/l), žluté vodorovné čárky onaznačují break-point. Kmen má citlivost menší než break point u Ceftazidimu, Ciprofloxacinu a Tobramicinu. Jamka označená C - kontrola růstu (jen MH bujón, žádné antibiotikum).
ikona Destičky lze inokulovat i automatickým inokulátorem. Inokulum je v misce vpravo.
ikona Odečítání výsledků je možné i pomocí fotometru - měří se zákal v jamkách.