Půdy.

Bakterie v mikrobiologii kultivujeme (pěstujeme) na tekutých a pevných živných půdách. Tekuté půdy se skládají ze směsi živin rozpuštěných ve vodě, zatímco pevné půdy se skládají ze směsi živin obohacujících agarový gel. Viz příprava půd.
V tekuté půdě se růst projevuje nejčastěji zákalem. V laboratorní diagnostice se dnes používají omezeně u některých chudých vzorků (hemokultivační nádobka pro záchyt bakterií z krve, Šulova půda u mykobaktérií) . 

 

ikona   Na pevných půdách vyrostou z jednotlivých naočkovaných bakterií tzv. kolonie.  Kolonie je kopeček biomasy na povrchu pevné půdy. Každá kolonie obsahují velké množství stejných bakteriálních buněk odpovídajích buňce původní. Kolonie lze kličkou snadno přenést do dalších půd či analyzátorů o odděleně tak sledovat či měřit fyziologické projevy bakterií odpovídajících původnímu vzorku. Běžné druhy bakterií tvoří na povrchu pevné půdy viditelné kolonie za 16-24 hodin. Jednotlivé druhy bakterií se často liší již vzhledem svých kolonií.  

 

Existuje celá řada hledisek, kterých se používá při hodnocení kolonií:

Tvar kolonií

  • Okrouhlý
  • Laločnatý
  • Obláčkovitý

Okraj kolonií

  • Pravidelný
  • Nepravidelný
 Povrch kolonií
  • Hladký
  • Lesklý
  • Matný
  • Drsný
  • Vrstevnatý
  • Zrnitý
 Zbarvení kolonií
  • Šedobílé - většina baktérií.
  • Diagnostické půdy obsahují barevný indikátor, zbarvuje zbarvuje kolonie podle produkovaných enzymů. Příklad: MacConkey
  • Některé bakterie produkují pigmenty.
 Konzistence kolonie
  • Mazlavá - hlenovitá
  • Drsná (suchá)
  • Hladká
  • Kolonie vrostlá do agaru
 Charakteristický zápach kolonie Reakce půdy v okolí kolonie
  • Obvykle žádná.
  • Někdy změna barvy, hlavně u diagnostických půd (např. změna pH => změna barvy indikátoru)
  • Krevní agar - degradace hemoglobinu či lýza erytrocytů přidaných do půdy (hemolýza) patří mezi významné diagnostické znaky:
        - alfa hemolýza - viridace - tvoří se meziprodukty (zelenohnědé zbarvení)
        - beta hemolýza - projasnění půdy způsobené difúzí uvolněného hemoglobinu do okolí
        - negativní hemolýza - barva půdy beze změny 

 

ikona Pigmentované kultury různých pseudomonád.

 
ikona Kultury streptokoků na krevním agaru
  • alfa streptokoky vlevo nahoře (viridace)
  • beta streptokoky dole (úplná hemolýza)
  • gama streptokoky vpravo nahoře (žádná hemolýza)


Podmínky kultivace ne pevných půdách
- Dostatek živin (zdroj N, C)
- Vlhkost (pro příjem živin) 
- Ideální teplota pro většinu 37°C (může se pohybovat od velmi nízkých až po značně vysoké)
- Optimální pH (běžné pH 7-7.2, ale u laktobacilů 3 a např. u cholery 8)
- Optimální atmosféra (vzhledem ke vztahu ke kyslíku - aerobní, anaerobní, striktně či fakultativně…)

Rozdělení kultivačních půd podle účelu
- Půdy univerzální neboli základní - slouží pouze k pomnožení mikrobů.
- Půdy diagnostické - obsahují indikátory, které obvykle mění barvu v závislosti na změně podmínek okolí (nejčastěji pH) v důsledku pochodů vyvolaných mikroby. Podle odlišných vlastností poté můžeme odlišovat jednotlivé mikroby. Např. na krevním agaru kolem kolonií některých druhů vzniká zóna hemolýzy; v tekuté půdě s určitým sacharidem a  barevným indikátorem pH lze odhalit schopnost kmene fermentovat tento sacharid.
- Půdy selektivní - potlačují růst nežádoucích mikrobů. 
- Půdy selektivně diagnostické - sdružují v sobě vlastnosti obou předchozích skupin. Příklad: MacConkey agar umožňuje růst nenáročných G- tyček a současně identifikuje jejich schopnost fermentovat laktózu. 
- Půdy speciální - slouží pro kultivaci konkrétního druhu nebo rodu bakterie. Příklad: půda BCYE pro legionely.

Rozdělení kultivačních půd podle složení 
- Definované půdy - přesné chemické složení jednotlivých půd.
- Nedefinované půdy - některé složky jsou vágně definovány - např. pepton (t.j. směs natrávených bílkovin) 
 
Agar
Je základní nosnou strukturou většiny pevných půd. Jeho výhodou je stabilita (bakteriemi je jen výjimečně hydrolyzován). Skládá se ze dvou složek - agarózy a agaropektinu. Vařen ve vodě se rozpouští, zpět polymerizuje asi při 35°C. Vytvoří submikroskopickou síťovinu poutající tekutý obsah. Vyrábí se z řasy Agar-Agar (chaluha, která roste v Pacifiku). Původně se přidával do tekutých základů půd,
dnes je agar nejčastěji součástí  hotových sušených půd v prášku. Pevné půdy obvykle obsahují 2% agaru. Viz příprava půd. 

Některé důležité kultivační půdy:


Živný (masopeptonový) agar (ŽA, MPA).
Základní směs - bujónem a peptonem s agarem.
Pěstují se na něm nenáročné bakterie.
Obvykle se používá spíše jako základ pro přípravu složitějších půd.

Krevní agar (KA)
Je nejpoužívanějším pevnou půdou, vyrábí se přidáním beraních krvinek k chladnoucím agaru (56°C). 
Slouží pro zachycení Gram + bakterií. Je částečně diagnostickou půdou - mohou se na něm projevit hemolytické vlastnosti bakterie.

Čokoládový agar (ČA)
Vyrábí se podobně jako KA přidáním beraních krvinek k agaru (ten má však vyšší teplotu 80°C) - a tak dojde k hemolýze.
Ta způsobí čokoládové zbarvení. Používá se pro pěstování náročnějších baktérií jako jsou Neisserie a Hemofily.

Levinthalův agar (LA)
Připravuje se stejně jako ČA, ale před nalitím na Petriho misku se přefiltruje přes jemný filtr, který zachytí cytoplazmatické membrány zhemolyzovaných krvinek. Tím se živiny zpřístupní bakteriím. LA patří mezi nejvýživnější půdy - obsahuje NAD a hemin - je vhodný pro záchyt Hemofilů. 

MacConkeyho půda/agar (MCA)
Diagnostická půda pro enterobakterie. Složení: ŽA + laktóza + Na2SO3 + indikátor (neutrální červeň). Můžeme na ní rozdělit enterobakterie (E. coli od salmonel, shigel) podle toho zda zkvašují laktózu => změna pH => změna barvy kolonie z růžové na červenou.

Desoxycholátová půda/agar (DC)
Selektivně diagnostická půda, určená pro enterobakterie. Gram + bakterie zde nerostou. Složení: ŽA + citrátový roztok + desoxycholát sodný + laktóza + neutrální červeň. Bakterie zkvašující laktózu vyrostou na DC agaru v jasně červených koloniích. Bakterie produkující H2S vyrostou v černých koloniích.

Wilson-Blairova půda/agar (WB)
Selektivně diagnostická půda na které nerostou Gram + bakterie. Složení: ŽA + Bismut-sulfidový roztok + brilantová zeleň. Salmonely na této půdě vysráží Bi a rostou v černých koloniích. Ostatní enterobakterie vyrostou v šedomodrých koloniích. Gram + bakterie na této půdě nevyrostou. 

Clauberghova půda/agar (CA)
Selektivně diagnostická půda. Složení: ŽA + glycerinovaná krev + cystein + vodní modř + metachromová žluť + teluričitan draselný (KTe4). Slouží k záchytu Corynebacterium diphtheriae. Ta při růstu vyredukuje Te z KTe4 - jasně černé zbarvení kolonií. 
Na podobném principu funguje Tinsdalův agar. 

Sabouraudův agar (SA)
Speciální půda používající se pro kvasinkové a plísňové mikroorganismy. Složení: ŽA + maltóza (nebo dextróza) + pepton (AMK výtažek). Pěstujeme na ní kandidy - smetanově bílé kolonie, které jsou cítit po droždí.

Löwenstein-Jensen-Holmova půda (LJHA)
Speciální půda pro pěstování mykobakterií. Složení: ŽA + asparagin + glycerin + škrob + čerstvé vejce + malachitová zeleň
Na rozdíl od jiných půd se nalévá většinou do zkumavek, kde se nechává šikmo ztuhnout. Mycobacterium tuberculosis na této půdě roste ve žlutavých koloniích. 


Chromogenní půdy
Moderní kategorie diagnostických půd, které dokáží odlišit jednotlivé mikroby na základě specifické barvy jejich kolonií. Existuje celá řada chromogenních půd, které od sebe dokážou odlišit například jednotlivé druhy kandid, jednotlivé druhy bakterií působící časté infekce močových cest nebo dokáží označit meticilin rezistentní Staphylococcus aureus (MRSA) či meticilin rezistentní Staphylococcus epidermidis (MRSE).

Různých dalších moderních komerčně dostupných půd jsou desítky.