Obsah: 

1. dvoudenní téma – morfologie, kultivace na tuhé půdě, 2. a 3. výukový týden 2016/2017

2. dvoudenní téma – identifikace kmene, 4. a 5. výukový týden 2016/2017

3. dvoudenní téma – stanovení citlivosti kmene, 6. a 7. výukový týden 2016/2017


 1. dvoudenní téma – morfologie, kultivace na tuhé půdě, 2. a 3. výukový týden 2016/2017

První dvoudenní praktikum je úvodní postup při stanovení přítomnosti bakteriálního původce v odebraném vzorku od pacienta. Základní metodou je kultivace za účelem získání čisté kultury. Fyziologické projevy původce jsou tak náležitě zesíleny a lze je později použít k identifikaci. Mikroskopické vyšetření je rovněž cenné, ale jen málokdy umožňuje definitivní závěr. 

   

Úloha č. 1: Mikroskopická morfologie bakteriální směsi ze vzorku. Provádí se první den. Cílem je osvojit si přípravu preparátu, práci s imerzním objektivem, vidět rozličné tvary bakterií a uvědomit si značné množství bakterií na osídleném povrchu. 

  • Zdrojem bude hlen ze sulcus dentogingivalis. Studenti si ráno před prvním dnem praktika doma hlen odeberou a natřou na podložní sklíčko. Odběr provedou před hygienou úst. Za tím účelem dostanou předem sklíčko a sterilní zabalené párátko. Materiál je třeba rozetřít na dostatečně velkou plochu sklíčka, aby preparát nebyl příliš hustý. 
  • Na praktiku si studenti sklíčko označí a preparát fixují metanolem v kyvetě (pozor, jed!).
  • Po oschnutí sklíčka si studenti preparát obarví podle Grama a pozorují imerzním objektivem (celkové 1000x zvětšení).  
  • Do protokolu si zakreslí tvary pozorovaných bakterií, zda jsou grampozitivní či gramnegativní a případně porovnají jejich velikost s epitelovou buňkou, bude-li přítomna.  

Úloha č. 2: Technika očkování výtěru na krevní agar. Cílem je seznámit se s očkováním na tuhou půdu a s rozličnou morfologii kolonií. Provádí se první a druhý den.

  • Studenti první den provedou před zrcadlem výtěr z vlastního krku, ráno před snídaní a před ústní hygienou. Za tím účelem předem dostanou výtěrovky a transportní půdu. Tampón po odběru vloží do zkumavky s transportní půdou.
  • V laboratoři si studenti předem na dně označí pevnou kultivační půdu (krevní agar).
  • Studenti předepsaným způsobem otřou tampón o povrch kultivační půdy.
  • Pomocí jednorázových sterilních plastových kliček materiál naočkují.
  • Po naočkování studenti půdy vloží do termostatu.
  • Druhý den půdy prohlédnou a připraví mikroskopický preparát z jednotlivých morfotypů kolonií. Preparát fixují, obarví podle Grama a pozorují pod mikroskopem. Přesvědčí se tak, že jde o čisté kultury.

 

 

Úloha č. 3: Semikvantitativní stanovení počtu bakterií v moči pacienta. Provádí se první a druhý den. Studenti pracují ve skupinách (2 skupiny v každé řadě). Cílem je ukázat jednu z technik stanovení počtu bakterií v tekutém vzorku na příkladu vyšetření moče a seznámit se s Uricultem. Moč bude představovat tekutina v odběrové nádobce s přidanými bakteriemi (fermentující G- tyčky). Nejčastějším vyvolavatelem infekcí močového traktu jsou G- fermentující tyčky, např. Escherichia coli. Nález je hodnocen podle nalezené bakteriurie - u dospělého jinak zdravého pacienta je závažný nález alespoň 105 bakterií v 1 ml moče odebrané metodou středního proudu. Metoda je popsána na videu Odběr moče pro bakteriologické vyšetření.  

  • První den studenti Uricult podle návodu naočkují a vloží do termostatu. 
  • Druhý den studenti stanoví počet bakterií v původním vzorku pomocí obrázkového vzorníku.  
  • Pozn.: Ve druhém dvoudenním tématu budou studenti provádět biochemickou identifikaci stejného kmene. 
  • Pozn.: Kvantativní stanovení je rovněž možné - viz studijní materiály  

 

Úloha č. 4: Barvení podle Ziehl-Neelsena. Studenti budou prohlížet předem připravené obarvené preparáty sputa pacienta trpícího otevřenou tuberkulózou. Provádí se první nebo druhý den. Barvicí postup je ukázán ve studijních materiálech (videoklip). Koncentrované horké barvivo je překážkou provádění této metody samotnými studenty.


Studijní materiály - odkazy:  

Laboratorní metody průkazu původce :

Poznámka: Fotografie a klipy se spouštějí přejetím nad zmenšeninou, ne klikáním. V prohlížeči musí být povolen skript. Stránka nefunguje v prohlížeči Microsoft Edge.

Odběr moče pro bakteriologické vyšetření. (Návod k použití soupravy Uricult pro rodiče ambulantních dětských pacientů). 

 



2. dvoudenní téma – identifikace kmene, 4. a 5. výukový týden 2016/2017

  • V předchozím praktiku jste si vyzkoušeli prvního krok kultivačního vyšetření - získání čisté kultury kmene ve formě izolované kolonie na tuhé půdě. Nyní jde o taxonomické zařazení kmene do příslušného druhu. K tomu se využívá například biochemické stanovení souboru enzymů, které kmen produkuje nebo nověji analýza proteinů kmene hmotnostní spektrografií. Na praktiku si budete provádět první z těchto metod, protože hmotnostní spektrograf nelze na praktiku provozovat. 
  • Jako ukázku rychlé mikrobiologické diagnostiky provedete stanovení antigenu Streptococcus pyogenes přímo z výtěru z krku. Metoda se široce používá v ambulantní praxi.

 

Úloha č.1.: Biochemické stanovení druhu kmene gramnegativních tyček, který již byl podle předběžných testů (negativní OXItest a pozitivní OFtest) zařazen do čeledi Enterobacteriaceae. Ke stanovení druhu v rámci této čeledi slouží souprava Enterotest 24N. Souprava odděleně stanovuje tvorbu 24 různých enzymů.  Druh se z výsledků určuje automatizovanou výpočetní metodou. Druhové zařazení je založeno na výpočtu. taxonomické vzdálenosti kmene od typických profilů jednotlivých druhů. Shoda nemusí být stoprocentní, podle okolností stačí např. 90% shodných znaků. Provádí se první a druhý den praktika. Pravděpodobnostní diagnostické postupy se používají např. i  při stanovení diagnózy infekčního onemocnění podle přítomných příznaků. Podmínkou úspěšného postupu jsou předem známá data četnosti výskytu jednotlivých znaků (příznaků) u taxonu (nemoci). 

PRVNÍ DEN:

1. Naočkování diagnostické soupravy Enterotest 24N.


Příprava inokula

• Z čisté 24 h kultury připravte ve fyziologickém roztoku suspenzi o hustotě 1 McF: Hustotu stanovíte porovnáním se zkumavkovým standardem, nejlépe proti světlu. Slabší nebo hustší suspenze může vést k falešným reakcím! Suspenzi dobře homogenizujte (pomocí Vortexu).

Příprava destičky ENTEROtest 24 N: 

• Otevřete aluminiový sáček odstřihnutím těsně vedle sváru a vyjměte destičku. 
• Pomocí skalpelu odřízněte příslušný počet řad (stripů) destičky, odpovídající počtu testovaných kmenů (3 řady, tj. 3x8 testů, pro identifikaci jednoho kmene). Každá skupina studentů určuje jeden kmen tj. potřebuje tři stripy.
• Vyříznuté řady vyjměte z panelu, sejměte ochrannou Al fólii, řady umístěte do připraveného prázdného rámečku. 
• Zaznamenejte čísla vyšetřovaných kultur na příslušné stripy.

Tip: Mezi jednotlivými stripy ponechte v rámečku mezery. Snížíte tak možnosti chyby způsobené kontaminací sousedních stripů inokulovanou suspenzí. 

Inokulace jamek: 

• Inokulujte 0,1 ml suspenze do všech jamek stripu.
• K prvním pěti jamkám prvého řádku (H, G, F, E a D s testy URE, ARG, ORN, LYS, H2S) přidejte po inokulaci po 2 kapkách parafinového oleje. Reakce zde probíhají pouze za nepřístupu vzduchu.
Poznámka: Víčko destičky je na příslušných pozicích potisknuto zkratkami testů a symbolem kapka: "zakapat parafínovým olejem".
V případě, že víčko v průběhu práce používáte na přikrytí destičky, před použitím jeho vnitřní stranu otřete ethanolem.

Inkubace:

• Vložte rámeček destičky s naočkovanými řadami do inkubačního PE sáčku.
• Otevřený konec sáčku zahněte pod destičku, aby nedošlo k vysychání inokula.
• Vložte destičku ENTEROtestu 24 N do termostatu, nastaveného na teplotu 37 °C, a inkubujte po dobu 24 hodin.

 

2. Doplňkový test na tvorbu indolu:

Test je užitečný např. pro přesnější identifikaci klebsiel. Není součástí stripu - provádí se zvlášť. 

Princip: Principem testu je hydrolýza tryptofanu na indol, pyruvát a amoniak.
Potřeby pro práci s INDOLtestem:

• Filtrační papír (např. Whatman č.1)
• Běžné laboratorní mikrobiologické vybavení (kličky, popisovače apod.)

Pracovní postup:

• Použijte 18 - 24 hodinovou kulturu z kultivačního média obsahujícího trypton (tryptofan), nejlépe krevní agar.
• Kápněte kapku roztoku INDOLtest na filtrační papír tak, aby byl dostatečně navlhčený.
• Očkovací kličkou vetřete několik kolonií testované kultury do zóny kapky. Papír nesmí před nanesením kolonií vyschnout.
• Nechte inkubovat při laboratorní teplotě po dobu 2 - 5 minut.
• Zhodnoťte barevnou reakci přímo na zóně kapky roztoku na filtračním papíru, podle zbavení. Pozitivní = modro-zelená; negativní = růžová.

DRUHÝ DEN

Odečtení a vyhodnocení výsledků Enterotestu: 

Pro hodnocení barevných reakcí použijte barevnou srovnávací tabulku pro soupravu ENTEROtest 24 N. Výsledky zaznamenejte do formuláře pro záznam výsledků dodávaného se soupravou. 


K případné identifikaci pomocí kódové knihy umožňuje formulář pro záznam výsledků snadno vytvořit tzv. profil, tj. číselný kód, podle nějž pak lze vyhledat výsledek identifikace. Do příslušných okének v řádku "Profil" se napíší součty čísel u pozitivních reakcí. Tak v řádku vnikne šestimístný kód. Kmen pak lze podle kódu najít pomocí vyhledávače.   

Proč se místo tabulek raději k interpretaci výsledků používá pravděpodobnostní přístup? Odpověď je zde: http://mikrobiologie.lf3.cuni.cz/bak/uceb/obsah/ident/ident.htm  

Interpretaci dat získaných Enterotestem zkuste provést: 

  • pomocí identifikačního programu TNW. To je program přímo pro Enterotest. Ukázka vkládání dat: tnw.wmv. Program je nainstalován v počítači ve cvičebně.
  • Pomocí Kódové knihy pro soupravu ENTEROtest 24 N. Otevřete soubor s kódovou knihou, zapněte vyhledávač a vložte do něj číselný kód získaného profilu kmene. Vyhledávač najde řádek odpovídající příslušnému druhu bakterie. Kniha byla původně papírová, ale se zvyšováním počtu testů i druhů by byla příliš objemná. 
  • pomocí databáze Gideon (na počítači v laboratoři jen pokud bude čas, jinak později pomocí vlastního PC).

 Ve všech případech je tedy třeba mít počítač.

  • Program TNW si můžete předem stáhnout a nainstalovat: setup.zip . Po rozbalení je nutno získaný soubor setup.dat přejmenovat na setup.exe  a spustit. Z nabízených instalací použijte tu minimální. Při spuštění programu použijte "30denní verzi".  Program naší fakultě poskytla firma Erba Lachema pro výukové účely. Implicitně program žádá připojení automatické čtečky stripů, kterou nemáte. Hlášku ignorujte odkliknutím. V nastavení TNW lze toto automatické čtení zrušit.  
  • Kódovou knihu pro Enterotest 24N si můžete stáhnout jako pdf: Enterotest.pdf. Návod k vytvoření kódu: Enterotestuvod.pdf . Leták: Enterotestletak.pdf. Bude rovněž 
  • Odkaz na databázi Gideon najdete na http://www.lf3.cuni.cz/cs/pracoviste/svi/journal/aktuality/hlavni/2015_GIDEON.html . Databázi fakultě zkušebně poskytla firma Gideon Informatics.

Gideon:

Spustí se modul Microbiology a vloží se údaje o určovaném kmenu. Kladný výsledek se vkládá kliknutím do příslušného okénka levým tlačítkem myši, záporná pravým tlačítkem. Neprováděné testy se nevkládají. 

Předem, nezávisle na vzorku se vloží: 

Phenotypic tests:

  • Gram negative + 
  • Bacillus or coccobacillus +
  • Facultative +
  • Growth on ordinary blood agar +
  • Growth on MacConkey agar +
  • Oxidase- 
  • Catalase +
  • Glucose fermenter +

Dále se vkládají individuální výsledky získané Enterotestem. Níže je pro usnadnění uveden vždy název testu v Gideonu, název v Enterotestu, pozice testu na stripu:

General tests:
Indole = INDOL (přídatný test)
*ONPG (beta galactosidase) = ONP (A1)
*Citrate = SCI (C1)
*Hydrogen sulfide = H2S (D1)
*Malonate = MAL (B1)
*Esculin hydrolysis = ESL (B3)
*Urea hydrolysis = URE (H1)
*Arginine dihydrolase = ARG (G1)
*Lysine decarboxylase = LYS (E1)
*Ornithine decarboxylase = ORN (F1)
Fermentation and Acidification:
*Adonitol = ADO (G3)
*D-Arabitol = ART (E3)
*Cellobiose = CEL (E2)
*Dulcitol = DUL (H3)
*myo-Inositol = INO (D4)
*Lactose = LAC (D2)
*D-Mannitol = MAN (B2)
*Mellibiose = MLB (F2)
*Raffinose = RAF (C3)
*Salicin = SAL (H2)
*D-Sorbitol = SOR (G2)
*Sucrose = SUC (E3)
*Trehalose = TRE (C2)
*D-Xylose = bXY (A3)

Již v průběhu vkládání můžete pozorovat zpřesňující se druhové zařazení kmene. 

Doma zkoušejte i infektologickou databázi GIDEON. Smyslem praktika je ukázat pravděpodobnostní diagnostiku obecně, ne jen u bakterií.

 

 

Úloha č. 2: Rychlé stanovení přítomnosti Streptococcus pyogenes ve výtěru z krku (na odebraném tampónu). 

Pro rychlý přímý průkaz původce se používá mj. imunochromatografické stanovení jeho antigenu ve vzorku (jiný název je Lateral flow immunoassay). Tato metoda se používá např. ke stanovení Streptococcus pyogenes ve výtěru z krku u pacienta trpícího angínou (antibiogram je zde bezpředmětný, protože lékem volby u této etiologie bude penicilin). Metoda se běžně používá také např. ke stanovení toxinů Clostridium difficile ve stolici pacienta trpícího průjmem nebo ji lze použít třeba i k rychlému průkazu biologické zbraně v podezřelé zásilce

Princip je popsán např. zde: http://www.cytodiagnostics.com/store/pc/Lateral-Flow-Immunoassays-d6.htm . Hledaný antigen, je-li ve vzorku přítomen, difunduje směrem k volně rozptýlené specifické protilátce v soupravě. Tato protilátka je předem konjugována s barevnými mikročásticemi (koloidní zlato nebo obarvené latexové mikročástice). Odtud dále difunduje komplex antigen-značená protilátka, v negativním případě (není-li hledaný antigen přítomen) jen značená protilátka unášená rozpouštědlem. Komplex antigen-protilátka je po cestě zachycen další protilátkou proti prokazovanému antigenu, která je tentokrát pevně uchycena. Tak vznikne barevný proužek signalizující přítomnost hledaného antigenu. Pro kontrolu je o kus dál pevně uchycena protilátka proti značené protilátce. Tak vznikne druhý proužek signalizující správně provedenou reakci. U pozitivních vzorků tak vidíme proužky dva, u negativního jeden.

Návod je zde: StrepA.pdf . Před prací si jej pečlivě prostudujte.

Studenti si PRVNÍ DEN ve skupinách provedou průkaz přítomnosti Streptococcus pyogenes na dodaném již infekčním tampónu (nestrkat to krku !!!), kultivační metodou a imunochomatograficky. Některé tampóny budou obsahovat jen bakterie běžné flóry. 

  • Studenti otřou tampón o povrch krevního agaru. Kličkou materiál rozočkují. 
  • Pak týž tampón použijí k imunochromatografickému vyšetření. Zatímco imunochromatografické vyšetření bude hotové za 15 minut, kultivační bude DRUHÝ DEN
  • Výsledky obou postupů studenti porovnají a porovnají i jejich citlivost.   

 



3. dvoudenní téma – stanovení citlivosti kmene, 6. a 7. výukový týden 2015/2016

  • V předchozím tématu jste si zkusili identifikovat neznámý kmen. 
  • Zbývá ještě stanovit jeho citlivost k antibiotikům, což je obsahem tohoto praktika. K tomu si vyzkoušíte účinnost dezinfekce rukou a seznámíte se s hemokulturou.

Pro téma antibiotika si studenti si předem osvojí základy uvedené v příručce http://old.lf3.cuni.cz/mikrobiologie/bak/uceb/index.html  - všechno ze sekce průkaz přímý/ průkaz kultivační/ antibiotika.    

Pro téma hemokultura si studenti předem osvojí základy uvedené v příručce  http://old.lf3.cuni.cz/mikrobiologie/bak/uceb/index.html  - sekce průkaz přímý/ průkaz kultivační/ druhy materiálu/ hemokultura nebo přímo http://old.lf3.cuni.cz/mikrobiologie/bak/uceb/obsah/hemok/hemok.htm  a dále v instruktážním filmu http://old.lf3.cuni.cz/ustavy/mikrobiologie/film/hemokultura.wmv případně v jiném podobném materiálu, který si najdou na internetu. 

 

 

Úloha č. 1: Stanovení citlivosti kmene k antibiotikům.

Jednotlivé druhy druhy bakterií jsou přirozeně rezistentní k některým antibiotikům, což je o nich předem známo. Navíc však mohou některé kmeny těchto druhů nově jevit rezistenci k dalším antibiotikům. Ta vznikne spontánně mutací nebo horizontálním přenosem příslušného genu z jiné již rezistentní bakteriální buňky do buňky citlivé (konjugací, transformací, transdukcí). Na vzniku rezistentního kmene z rezistentní buňky se pak zpravidla významně podílí selekční tlak příslušného antibiotika. Stupeň rezistence bakteriálního kmene k antibiotiku se časem může dále zvyšovat. Aby mikrobiolog umožnil racionální terapii bakteriální nákazy, provádí během kultivačního vyšetření vzorku stanovení citlivosti zjištěného vyvolavatele k antibiotikům. Sestava použitých antibiotik se liší podle druhu vyvolavatele a podle klinické diagnózy pacienta.

Stanovení citlivosti se rutinně provádí fenotypovými metodami, které jsou spolehlivé, levné, avšak pomalé. Rychlejší stanovení genu rezistence se někdy provádí ve vybraných případech (např. molekulárně genetické stanovení rezistence stafylokoků k oxacilinu).

Na praktiku si studenti budou provádět stanovení citlivosti kmene diskovou difúzní metodou a E-testem. Disková metoda určí, zda je testovaný kmen citlivý nebo rezistentní ve vztahu k dosažitelným tkáňovým koncentracím antibiotika při léčbě. Je to metoda kvalitativní. E-test naproti tomu stanovuje tzv. minimální inhibiční koncentraci antibiotika pro vyšetřovaný kmen (MIC). Interpretace změřené MIC je opět ve vztahu k farmakokinetice přípravku. 

1. Disková difúzní metoda (Kirby-Bauer)

Princip: Na povrch tuhé půdy (Mueller-Hintonův agar) se plošně naočkuje zkoumaný kmen. Na půdu se pak položí sestava antibiotických disků. Jsou to šestimilimetrová kolečka z vhodného materiálu obsahující přesná množství různých antibiotik. Půda se následně inkubuje v termostatu. Dochází zde jednak k plošnému  exponenciálnímu množení bakterií na povrchu půdy, jednak k plošné logaritmické difúzi antibiotika z disku do půdy. V nějaké vzdálenosti od disku bude v jednu chvíli ("kritický čas" - nejčastěji 4 - 10 hodin) na povrchu půdy již tolik bakterií a dosud tak málo antibiotika, že ani později se zvyšující koncentrace antibiotika jejich množení nezastaví. Spodní vrstvy bakterií toto přibývající antibiotikum zachytí. Bakterie i nepatrně blíž k disku naproti tomu budou antibiotikem inhibovány. Tak se založí okraj kruhové inhibiční zóny kolem disku, která se již nemění, jen se časem zviditelní tloustnutím bakteriálního povlaku. Pouhým okem je inhibiční zóna dobře viditelná za 18 hodin. Při použití speciálního optického zařízení lze zónu odečíst dřív.

Při stejné kvantitativní citlivosti dvou různých druhů bakterií mohou být inhibiční zóny v důsledku jejich rozdílné růstové rychlosti různě velké (pomaleji rostoucí stejně citlivý druh bude mít zónu větší).

Koncentrace antibiotika na okraji právě se tvořící inhibiční zóny je blízká tzv. Minimální inhibiční koncentraci (MIC) - viz níže. Průměr inhibiční zóny tak závisí na kvantitativní citlivosti kmene. Disková metoda je ale pro kvantitativní stanovení citlivosti nevhodná, protože v praxi lze těžko docílit potřebné přesnosti měření. Průměr inhibiční zóny se proto interpretuje jen rámcově, kvalitativně, podle mezinárodně přijatých standardů (zone diameter breakpoints) a výsledkem je výrok "citlivý" nebo "rezistentní", v některých zemích i "intermediálně citlivý", podle změřeného průměru zóny. Poslední kategorie může znamenat, že antibiotikum bude in vivo účinné jen tam, kde se v organizmu koncentruje, např. v moči. Pojem "rezistence" u diskové metody neznamená, že antibiotikum není vůbec schopno růst kmene inhibovat. Znamená, že nelze  docílit potřebnou léčebnou koncentraci antibiotika v organismu pacienta. Ale jak velká je rezerva u citlivých kmenů disková metoda neurčuje.

2. E-test.

E-test umožňuje stanovení MIC. Je to opět difúzní metoda. Místo disků se na povrch naočkovaného Mueller-Hintonova agaru klade proužek obsahující antibiotikum ve snižující se koncentraci od jednoho konce k druhému. Během inkubace dochází ke stejným jevům jako při diskové metodě. Výsledná inhibiční zóna není kruhová, ale kapkovitá, zužující se směrem ke snižující se koncentraci antibiotika v proužku. V místě, kde množství antibiotika v proužku odpovídá MIC, okraj inhibiční zóny splyne s okrajem proužku. Zde na stupnici přímo přečteme vytištěnou hodnotu MIC pro testovaný kmen. E-test je 100x dražší, než disk. Proto se používá omezeně)*.

In vitro zjištěná MIC kmene se  porovnává s tzv. hraniční koncentrací antibiotika (clinical breakpoint), což je hodnota smluvená uznávanými odborníky. Lze ji částečně vysvětlit farmakokinetickými vlastnostmi antibiotika (dosažitelné koncentrace v séru, rozsahem vazby na sérové proteiny, poločasu). Výsledkem je opět výrok  "citlivý" nebo "rezistentní".  Čím větší je rozdíl mezi MIC a breakpointem, tím bude antibiotikum z tohoto hlediska klinicky účinnější. Takovou klinickou rozvahu disková metoda neumožňuje. Při dobrých znalostech farmakodynamiky antibiotika event. s využitím speciálního software tak lze podle MIC optimalizovat terapii některých závažně nemocných pacientů. 

Stanovení MIC většího souboru kmenů za určité období umožňuje lépe sledovat vývoj rezistence v nemocnici a včas zasáhnout změnou druhu antibiotika. Těmito všemi činnostmi se zabývají Antibiotická střediska nemocnic.

Nicméně přístup k antibiotické léčbě jednotlivých pacientů bývá zejména na začátku onemocnění založen na orgánovém přístupu tj. určitá antibiotika se při určitém typu postižení upřednostňují. Tento přístup zohledňuje zkušenosti včetně obvyklého spektra původců onemocnění. Takový přístup je nezbytný vzhledem k víceméně vždy opožděnému výsledku kultivačního vyšetření. K volbě vhodného antibiotika zde slouží různé Antibiotické průvodce vydávané knižně nebo publikované na vnitřních sítích nemocnic. Příklad - nedokončený fragment překladu takového intranetového průvodce - fungují jen některé části. V praxi důležité jsou i  postupy  doporučené příslušnou lékařskou odbornou společností. 

 )* Jsou i další metody kvantitativního stanovení MIC, např. diluční bujónová metoda. Testovaný kmen se očkuje do řady jamek s tekutou půdou s postupně se snižující koncentrací antibiotika. Půda s nejnižší koncentrací antibiotika nevykazující známky růstu obsahuje tzv. Minimální inhibiční koncentraci antibiotika (MIC). Udává se v mg/l. Referenční metodou stanovení MIC zůstává diluční metoda agarová, kde se testované kmeny očkují na řadu agarových půd s postupně klesajícím obsahem antibiotika. Tato metoda je pro rutinní diagnostickou laboratoř nepraktická. Výhodou dilučních metod je, že antibiotikum působí od začátku v neměnné koncentraci na standardní bakteriální inokulum. Výsledky tak nejsou zatíženy složitými jevy provázejícími difúzi.  

Zrychlené fenotypové metody stanovení citlivosti k antibiotikům jsou založeny buď na fotometrickém sledování růstu bakterií v tekuté půdě s antibiotikem nebo na elektronickém zesílení obrazu při diskové metodě. V obou případech je výsledek k hotov v průměru za sedm hodin.

Provedení:

Studenti budou pracovat ve skupinách.

PRVNÍ DEN:

  • Dva Mueller Hintonovy agary studenti prohlédnou, nejsou-li kontaminovány. 
  • Pomocí kličky a vortexu si studenti připraví suspenzi testovaného kmene gramnegativní fermentující tyčky ve fyziologickém roztoku o hustotě 0,5 McFarlandovy stupnice (srovnáním se standardem proti oknu).
  • Do suspenze ponoří sterilní vatový tampón na špejli.
  • Tampón povytáhnou a lehce přitisknou na stěnu zkumavky, aby přebytek tekutiny stekl.
  • Tampónem plošně v jenom směru a pak v kolmém směru naočkují dva Mueller Hintonovy agary. Pokud je tampón příliš suchý, ponoří jej znovu do suspenze. 
  • Po skončení očkování tampón vyhodí do infekčního odpadu.
  • Pokud není povrch agaru suchý, počkají pět minut.
  • První naočkovaný agar na dnu označí svým jménem a číslem kmene a u okraje udělají značku u místa, kde bude ležet první disk.
  • Pomocí aplikátoru stiskem naráz umístí na povrch takto označené půdy šest disků)*: Značka na boku aplikátoru musí lícovat se značkou na dnu misky.    
  • Pomocí sterilní jehly se přesvědčí, že disky neupadnou, až bude miska dnem nahoru.
  • Misku s agarem zavřou víčkem a hned ji vloží do termostatu)**.
  • Na druhý agar studenti pomocí jehly položí proužek E-testu (Imipenem)
  • Misku s agarem na dně označí a hned ji vloží do termostatu víčkem nahoru.

)* Amoxycilin+klavulanát, trimetoprim, ampicilin, nitrofurantoin, imipenem, gentamicin. Při závažných onemocněních se testuje víc antibiotik na více miskách. Imipenem je zde hlavně z pedagogických důvodů pro porovnání s E-testem.

)** Delší odklad inkubace způsobí tzv. predifuzi antibiotika, takže zóny jsou pak arteficiálně větší. Podobný jev nastává u přeplněných termostatů - misky se pomalu prohřívají a růst bakterií se zpožďuje.

DRUHÝ DEN:

  • Pomocí měřítka si studenti změří a zapíší průměr všech inhibičních zón.
  • Průměry všech zón interpretují pomocí zkrácené tabulky dle EUCAST.
  • Studenti odečtou MIC na E-testu a výsledek interpretují dle níže uvedené zkrácené tabulky EUCAST. Porovnají výsledek stanovení citlivosti k Imipenemu diskovou metodou a E-testem.
  • Celá tabulka je pro informaci zde.

 

Enterobacteriaceae

EUCAST Clinical Breakpoint Table v. 5.0, valid from 2015-01-01

Disk diffusion (EUCAST standardised disk diffusion method)

Medium: Mueller-Hinton agar

Inoculum: McFarland 0.5

Incubation: Air, 35±1ºC, 18±2h

Reading: Read zone edges as the point showing no growth viewed from the back of the plate against a dark background illuminated with reflected light.

Quality control: Escherichia coli ATCC 2592

  E-test Disks

 

In order to simplify the EUCAST tables, the intermediate category is not listed. It is interpreted as values between the S and the R breakpoints. For example, for MIC breakpoints listed as S ≤ 1 mg/L and R > 8 mg/L, the intermediate category is 2-8 (technically >1-8) mg/L, and for zone diameter breakpoints listed as S ≥ 22 mm and R < 18 mm, the intermediate category is 18-21 mm.

 

Penicillins

MIC breakpoint (mg/L)

 

Disk content (µg)

Zone diameter breakpoint

(mm)

 

 

Sensitive

Resistant  >

 

Sensitive

Resistant  <

Ampicillin

8

8

10

14

14

Amoxicillin-clavulanic acid

8

8

20-10

19

19

           

Carbapenems

MIC breakpoint (mg/L)

 

Disk content (µg)

Zone diameter breakpoint

(mm)

 

 

Sensitive

Resistant >

 

Sensitive

Resistant <

Imipenem

2

8

10

22

16

           

Aminoglycosides

MIC breakpoint (mg/L)

 

Disk content (µg)

Zone diameter breakpoint

(mm)

 

 

Sensitive

Resistant >

 

Sensitive

Resistant <

Gentamicin

2

4

10

17

14

           

Miscellaneous agents

MIC breakpoint (mg/L)

 

Disk content (µg)

Zone diameter breakpoint

(mm)

 

 

Sensitive

Resistant >

 

Sensitive

Resistant <

Nitrofurantoin (uncomplicated UTI only)

64

64

100

11

11

Trimethoprim (uncomplicated UTI only)

2

4

5

18

15

 

Úloha č.2: Orientační stanovení účinnosti mytí rukou.

Na kůži rukou zdravého jedince je běžná bakteriální flóra, ale přechodně i další bakterie podle okolností. Studenti si jednoduchou otiskovou metodou ověří různé možnosti jejího odstranění. 

Postup: 

PRVNÍ DEN:

  • Každý student si označí dno misky s krevním agarem a označovačem si jej rozdělí na čtvrtiny: 1. prst, 2. prst, 3. prst, 4. prst.
  • První prst rovnou otiskne na příslušnou čtvrtinu povrchu krevního agaru. 
  • Druhý prst si umyje tekutým mýdlem, nechá volně uschnout a otiskne na další čvrtinu.
  • Třetí prst umyje tekutým mýdlem a poté dezinfikuje přípravkem Sterilium nebo Manusept. Po uschnutí jej otiskne na třetí čtvrtinu. 
  • Čtvrtý prst dezinfikuje shodně s třetím prstem, ale osuší jej pod elektrickým osušovačem rukou. Pak jej otiskne. 
  • Misku vloží do termostatu.

DRUHÝ DEN:

Student prohlédne svou misku a výsledek orientačně zhodnotí podle vyrostlých kolonií. Zaznamená účinný způsob dezinfekce rukou.  

 

 

Úloha č. 3: Hemokultura. Jen demonstrace, druhý den.

Pokud jde o mikrobiologii, při závěrečné ústní zkoušce je neznalost tohoto laboratorního vyšetření častou příčinou celkového neúspěchu studenta. Druhý den praktika bude proto hemokultura demonstrována a později ještě zmíněna při přednášce.

 


Závěr: Automatizace metod. Metody demonstrované na praktických cvičeních se v moderních diagnostických laboratořích automatizují, ale jejich podstatou stále zůstává analýza fenotypu, přes nástup molekulárně genetických postupů v některých oblastech. Automatizace metod spočívá ve využívání přístrojových agregátů propojených jednotným softwarem. Přístroje přijaté vzorky automaticky očkují na tuhé půdy, zhotoví mikroskopický preparát vzorku, pošlou naočkovanou půdu do termostatu, kamerou průběžně sledují růst kolonií a obraz znázorňují na velkoplošných monitorech, pomocí mikromanipulátoru z pracovníkem vyhlédnutých kolonií odebírají vzorky pro stanovení druhu hmotnostní spektrografií a pro stanovení citlivosti k antibiotikům. Automaticky volí sestavu antibiotik pro stanovení citlivosti kmene. Získané hodnoty citlivosti automaticky interpretují a výsledky posílají do nemocničního informačního systému. Dají se ovládat dálkově přes internet. Taková zařízení jsou velice výkonná, vyšetření se zrychluje a zlevňuje a tak se ve vyspělých zemích počet diagnostických laboratoří lékařské mikrobiologie rychle snižuje, v závislosti na rychlosti transportu vzorků a na místních politickoekonomických poměrech. Viz např. KIESTRA: http://www.bd.com/europe/labautomation/