Stanovení protilátek v séru pomocí westernblotu.

Při infekčním onemocnění se tvoří protilátky proti různým antigenům původce. Tam, kde ke spolehlivé diagnóze nestačí zjištění protilátek proti jednomu typickému antigenu původce, lze využít western blot. Je to přípravek jednotlivě indikující protilátky proti velkému počtu různých antigenů příslušného původce umístěných na společné podložce (proužku). Rozdělení směsi antigenů při hromadné výrobě blotů se děje elektroforeticky (v gelu). Antigeny se pak přenesou (přesají) na membránu. Ta se rozřeže na identické diagnostické proužky - stripy, které se prodávají. Přítomnost protilátky se v laboratoři projeví ztmavnutím příslušného místa proužku. Porovnáním s přiloženou šablonou (dodává výrobce) se zjistí antigeny, proti kterým pacient tvoří protilátky. 

Příklad: Základní diagnostiku klíšťové boreliózy lze provést běžným serologickým vyšetřením (ELISA). Soupravy pro IgG resp. IgM obsahují směs boreliových antigenů OspA, OspC a p-83/100. Pozitivní výsledek má ale jen orientační hodnotu. V případě pozitivity se proto pacientovo sérum vyšetří ještě  Western-blotem, který obsahuje mnohé další antigeny (viz obrázek vlevo). Podle nálezu protilátek proti těmto jednotlivým antigenům lze vazbu borelií k pacientovým zdravotním potížím výrazně zpřesnit pomocí tzv. interpretačních kritérií.

Pracovní postup:

		Proužky jsou vloženy do žlábků inkubátoru podle počtu vyšetřovaných vzorků.
		K proužkům jsou přidána vyšetřovaná séra jednotlivých pacientů.
			Během všech kroků stroj žlábky kýve a zrychluje tak jednotlivé reakce - vazbu protilátek na antigeny, vazbu konjugátu, barevnou reakci, ...
			...mezi jednotlivými kroky stroj odsaje tekutý obsah žlábků a proužky opakovaně promyje.
		Po navázání pacientových protilátek je zbytek séra odsát a proužky promyty. Je přidán konjugát, který reaguje s Fc fragmentem zachycených pacientových protilátek. Konjugát se vyrábí buď proti IgG nebo IgM, případně i proti IgA. Tak je možno detekovat odděleně (za využití 2 nebo 3 žlábků) každou třídu pacientových protilátek zvlášť.
		Po navázání je zbytek konjugátu odstát a proužky promyty. Je přidán enzymový substrát. Proběhne barevná reakce. Na místech vazby pacientových protilátek se objeví příčné proužky.
		Subtrát je odstát, bloty promyty, vyňaty, usušeny.
		Bloty na savém papíru - detail. Na druhém blotu zprava zřetelné proužky svědčící o přítomnosti protilátek.
		Poloha proužků porovnána se šablonou, která je přiložena ke každému balení blotů. Polohu proužků a jejich intenzitu lze odečítat i scannerem a obraz hodnotit speciálním software. Interpretace výsledků se provádí podle tzv. interpretačních kritérií, která stanovují význam protilátek proti jednotlivým antigenům původce. Interpretaci provádí mikrobiolog.
		Jiný příklad nezastupitelného postavení western-blotu: matka i dítě mají IgG protilátky proti ... Dítě však má navíc protilátky proti jednomu z antigenu původce (šipka). To svědčí o proběhlé transplacentární nákaze. Při vyšetření běžnou ELISOU by přitom vyšetření dítěte bylo interpretováno jen jako pasivní přenos matčiných IgG protilátek.
Záběry byly pořízeny v diagnostické laboratoři Vidia Diagnostika, Praha