|
|
Test se provádí
na zařízení Cepheid SmartCycler II. Má celkem 16 nezávislých pozic
pro kyvety.
|
|
|
SmartCycler používá speciální plastové kyvety, kde vzorek je umístěn v ploché svislé kosočtverčné komůrce. To usnadňuje výměnu tepla. Zespodu je vzorek osvícen a současně je snímána fluorescence.
|
|
|
V ovládacím programu cycleru uživatel vytvoří a uloží profil, který bude používán při určitém druhu vyšetření. Zde profil začíná dvouminutovým zahřátím na 95°C a pokračuje 40 dvouteplotními cykly, kdy při 60°C probíhá fluorescenční měření. Každému z prokazovaných původců je také přiřazena jiná barva světla emitovaného příslušnou sondou (zde 2 kanály + 1 pro interní kontrolu).
|
|
|
Z vyšetřovaného vzorku je třeba uvolnit DNA. Nejprve se k vzorku přidá tzv. interní kontrola (vhodně zvolená DNA lišící se od hledané, jejíž zdařilá amplifikace bude zárukou správně provedeného postupu). Extrakce DNA z buněk původce se provede enzymaticky vhodnou komerční soupravou. Uvolněná DNA se naváže na skleněná mikrovlákna, promyje se a opět uvolní snížením koncentrace solí. Všechny přípravné kroky se provádějí v laminárním biohazardním boxu, aby se předešlo laboratorní nákaze a také kontaminaci vzorku.
|
|
|
Do čisté zkumavky se napipetuje potřebné množství tzv. supermastermixu (obsahuje deoxyribonukleotidy dATP, dCTP, dGTP a dTTP, sondy, primery, reakční pufr atd.). Dvojice primerů jsou zde tři - pro Mycoplasma pneumoniae, pro Chlamydophila pneumoniae a pro interní kontrolu.
|
|
|
Do zkumavky se přidá Taq DNA polymeráza (1-2,5U).
|
|
|
Směsí se zatřepe, aby se řádně promíchala.
|
|
|
Do předchlazeného bloku se umístí amplifikační kyvety podle počtu vyšetřovaných vzorků, 1 kyveta navíc pro kontrolní vzorek, 1 kyveta navíc pro negativní kontrolu. Do všech kyvet se napipetuje po 20 µl směsi z předchozí zkumavky.
|
|
|
Do kyvet se pipetou přenese 5 µl vyizolované DNA z vyšetřovaných vzorků. Do pozitivní kontrolní kyvety se přenese kontrolní DNA identická s hledanými úseky. Je dodávána se soupravou. Do negativní kontrolní kyvety se místo vzorku přidá voda.
|
|
|
Kyvety se popíší.
|
|
|
Kyvety se krátce centrifugují, aby směs bezpečně stekla do komůrky. Kyvety se vloží do cycleru.
|
|
|
Pomocí řídicího počítače se aktivuje potřebný počet pozic pro kyvety (zde 2 pozice) a přiřadí se jim profil, který v nich má probíhat (zde "Multiplex"). Cycler umožňuje nezávislou činnost v každé z 16 pozic.
|
|
|
Cycler se spustí pomocí ovládacího softwaru na počítači.
|
|
|
Průběh procesu lze pozorovat na obrazovce. Celý proces proběhne asi za 40
minut.
|
|
|
Přestoupí-li světelný signál příslušné barvy nastavenou mez, je výsledek pozitivní. To lze pozorovat již během amplifikace. Šedá křivka zde svědčí o přítomnosti Mycoplasma pneumoniae ve vyšetřovaném vzorku, modrá o nepřítomnosti Chlamydophila pneumoniae. Po skončení amplifikace je výsledek vyjádřen ještě formou tabulky.
|
|
|
Kyvety se po skončení vyjmou a vyhodí jako běžný neinfekční materiál. (Amplikony obsahují jen zlomek genomu původce - nejsou infekční).
|