Stanovení původce metodou multiplex-PCR na světelném cycleru.

ikona   V úvodní části oddílu o genetickém průkazu původce metodou real-time PCR je pro jednoduchost uvedeno jen značení amplikonů fluorescenčním barvivem SYBR Green I. Tato barvička se váže na dvouřetězcovou DNA bez jakékoli sekvenční specifiky. Naproti tomu tzv. fluorescenční sondy se aktivují amplifikací DNA, která je k nim komplementární. Sondy mohou být osazeny různými barvivy (reportery) lišícími se jak účinnou vlnovou délkou dopadajícího excitujícího světla, tak vlnovou délkou buzeného emitovaného světla. Každá sonda navíc obsahuje i tzv. zhášeč (quencher), který energii získanou fotoexcitací reporteru vyzařuje v odlehlé, např. infračervené oblasti. Teprve po oddálení quencheru reporter fluoreskuje v očekávané barvě. To je princip např. sondy TaqMan: Nenavázaná sonda nefluoreskuje, rovněž po navázání na vzniklý amplikon ne, při dalším cyklu PCR však polymeráza sondu hydrolyzuje, její reporter se osamostatní a začne fluoreskovat.
ikona V jedné kyvetě tak lze využitím více sond lišících se jednak vazebnou částí, jednak barvou emitovaného světla,naráz prokazovat více původců či genů (multiplex PCR). To je vhodné tam, kde klinický obraz onemocnění zahrnuje více možných původců.

ikona

Příklad - průkaz Mycoplasma pneumoniae a Chlamydophila pneumoniae. Uvedená ukázka vychází z náplně studentských praktických cvičení z genetického průkazu původce v laboratoři Dynex, Praha 6:

ikona   Test se provádí na zařízení Cepheid SmartCycler II.  Má celkem 16 nezávislých pozic pro kyvety.
ikona SmartCycler používá speciální plastové kyvety, kde vzorek je umístěn v ploché svislé kosočtverčné komůrce. To usnadňuje výměnu tepla. Zespodu je vzorek osvícen a současně je snímána fluorescence.
ikona V ovládacím programu cycleru uživatel vytvoří a uloží profil, který bude používán při určitém druhu vyšetření. Zde profil začíná dvouminutovým zahřátím na 95°C a pokračuje 40 dvouteplotními cykly, kdy při 60°C probíhá fluorescenční měření. Každému z prokazovaných původců je také přiřazena jiná barva světla emitovaného příslušnou sondou (zde 2 kanály + 1 pro interní kontrolu).
ikona   Z vyšetřovaného vzorku je třeba uvolnit DNA. Nejprve se k vzorku přidá tzv. interní kontrola (vhodně zvolená DNA lišící se od hledané, jejíž zdařilá amplifikace bude zárukou správně provedeného postupu). Extrakce DNA z buněk původce se provede enzymaticky vhodnou komerční soupravou. Uvolněná DNA se naváže na skleněná mikrovlákna, promyje se a opět uvolní snížením koncentrace solí. Všechny přípravné kroky se provádějí v laminárním biohazardním boxu, aby se předešlo laboratorní nákaze a také kontaminaci vzorku.
ikona Do čisté zkumavky se napipetuje potřebné množství tzv. supermastermixu (obsahuje deoxyribonukleotidy dATP, dCTP, dGTP a dTTP, sondy, primery, reakční pufr atd.). Dvojice primerů jsou zde tři - pro Mycoplasma pneumoniae, pro Chlamydophila pneumoniae a pro interní kontrolu.
ikona   Do zkumavky se přidá Taq DNA polymeráza (1-2,5U).
ikona   Směsí se zatřepe, aby se řádně promíchala.
ikona Do předchlazeného bloku se umístí amplifikační kyvety podle počtu vyšetřovaných vzorků, 1 kyveta navíc pro kontrolní vzorek, 1 kyveta navíc pro negativní kontrolu. Do všech kyvet se napipetuje po 20 µl směsi z předchozí zkumavky.
ikona Do kyvet se pipetou přenese 5 µl vyizolované DNA z vyšetřovaných vzorků. Do pozitivní kontrolní kyvety se přenese kontrolní DNA identická s hledanými úseky. Je dodávána se soupravou. Do negativní kontrolní kyvety se místo vzorku přidá voda.
ikona Kyvety se popíší.
ikona Kyvety se krátce centrifugují, aby směs bezpečně stekla do komůrky. Kyvety se vloží do cycleru.
ikona Pomocí řídicího počítače se aktivuje potřebný počet pozic pro kyvety (zde 2 pozice) a přiřadí se jim profil, který v nich má probíhat (zde "Multiplex"). Cycler umožňuje nezávislou činnost v každé z 16 pozic.
ikona Cycler se spustí pomocí ovládacího softwaru na počítači.
ikona Průběh procesu lze pozorovat na obrazovce. Celý proces proběhne asi za 40 minut.
ikona Přestoupí-li světelný signál příslušné barvy nastavenou mez, je výsledek pozitivní. To lze pozorovat již během amplifikace. Šedá křivka zde svědčí o přítomnosti Mycoplasma pneumoniae ve vyšetřovaném vzorku, modrá o nepřítomnosti Chlamydophila pneumoniae. Po skončení amplifikace je výsledek vyjádřen ještě formou tabulky.
ikona Kyvety se po skončení vyjmou a vyhodí jako běžný neinfekční materiál. (Amplikony obsahují jen zlomek genomu původce - nejsou infekční).