Genetický průkaz původce.

Je-li v odebraném vzorku nalezen úsek nukleové kyseliny, který je pořadím basí A, G, C, T jedinečný a nemůže být ničím jiným, než úsekem genomu určitého vyvolavatele, může tento nález sloužit jako přímý průkaz vyvolavatele.

Genetické metody průkazu původce v infekčním vzorku nyní nejčastěji využívají polymerázovou řetězovou reakci (PCR). Při ní se v kyvetě znásobí (amplifikuje) obsah úseku DNA, o jehož průkaz se pokoušíme. Produktem amplifikace jsou amplikony. Amplifikací jediné přítomné hledané molekuly DNA získáme stamiliony molekul amplikonů. Ty je již (vzhledem k jejich množství) možno prokázat fyzikálně chemickými metodami. Není-li však ve vzorku přítomna ani jedna molekula prokazované DNA, amplifikace neproběhne, amplikony nevzniknou a reakce je negativní. Specifičnost PCR je zajištěna pořadím basí na primerech, které reakci startují - na jiný, než na prokazovaný úsek DNA se primery nenavážou a reakce se nerozběhne. 

Poznámky:

ikona   Animované schéma PCR. Primery vymezují vybraný specifický úsek DNA vhodný pro diagnostiku a jsou pro každého hledaného původce jiné. Mají unikátní sekvenci bazí na prokazovaném úseku DNA - odlišná DNA se proto amplifikovat nemůže. Polymeráza umožňující syntézu amplikonů je termostabilní enzym, není denaturována při teplotě 93ºC během denaturační fáze cyklu.  

Ovládací tlačítka vypnuta.
Copyright © 2000 The Royal Veterinary College University of London, Prof. Peter Chantler. 

ikona Cykler (cyklátor) je zvláštní inkubátor, ve kterém PCR probíhá. Cykler podle programu periodicky mění teplotu v kyvetách. Pro rychlý přestup tepla se dodávají speciální tenkostěnné event. žebrované kyvety, nebo (u light cycleru Roche) speciální skleněné kapiláry. Cyklerů je mnoho různých typů. Na ukázce je starší typ cykleru, do kterého je vkládán rámeček s naplněnými kyvetami. Vyhřívací blok cykleru k nim po dotažení víka těsně přilehne.Víko je vyhřívané, aby nedocházelo ke kondenzaci reakční směsi na víčkách.

Kontrola procesu při PCR

U PCR je nutno vyloučit falešně negativní i falešně pozitivní výsledek vyšetření. 

  • Falešně negativní výsledek někdy nastává např. za přítomnosti inhibitorů polymerázy (talek, heparin, močovina, složky hnisu). Falešně nagativní výsledek se vyloučí souběžnou amplifikací syntetického oligonukleotidu přidaného ke vzorku (interní kontrola). Nedojde-li k jeho amplifikaci, jde o selhání reakce. 
  • Falešně pozitivní výsledek nastává vzdušnou kontaminací dosud nevyšetřeného vzorku amplikony při neopatrném pipetování jiného pozitivního již amplifikovaného vzorku. Vzdušné kontaminaci se předchází stavebním oddělením jednotlivých úseků laboratoře, používáním boxů s bariérou laminárního proudu vzduchu anebo preventivním ošetřením vzorků uracil n glykosylázou ničící amplikony, ne však přírodní NK (master mix v tom případě obsahuje uracil místo thyminu a získavané amplikony se tak liší od přírodní DNA - systém AmpErase). U real-time PCR se kyvety pro amplifikaci vůbec neotevírají, ale rovnou vyhazují a tak je zde toto riziko nepoměrně menší.