Genetický průkaz původce.
Je-li v odebraném vzorku nalezen úsek nukleové kyseliny, který je pořadím basí
A, G, C, T jedinečný a nemůže být ničím jiným, než úsekem genomu určitého vyvolavatele, může
tento nález sloužit jako přímý průkaz vyvolavatele.
Genetické metody průkazu původce v infekčním vzorku nyní nejčastěji
využívají polymerázovou řetězovou reakci (PCR). Při ní se v kyvetě znásobí
(amplifikuje) obsah úseku DNA, o jehož průkaz se pokoušíme. Produktem amplifikace jsou
amplikony. Amplifikací jediné
přítomné hledané molekuly DNA získáme stamiliony molekul amplikonů. Ty je již (vzhledem k jejich množství)
možno prokázat fyzikálně chemickými
metodami. Není-li však ve vzorku přítomna ani jedna molekula prokazované
DNA, amplifikace neproběhne, amplikony nevzniknou a reakce je negativní.
Specifičnost PCR je zajištěna pořadím basí na primerech, které reakci
startují - na jiný, než na prokazovaný úsek DNA se primery nenavážou a
reakce se nerozběhne.
- PCR probíhá v cycleru, který provádí rychlé cyklické změny teploty,
které cyklicky působí denaturaci DNA, navázání primerů na oba řetězce
denaturované DNA a dostavění komplementárních řetězců (viz schema). Při každém cyklu se počet amplikonů zdvojnásobí.
- Při užití klasických cyclerů je se po skončení amplifikace obsah
kyvet zpracuje další metodou k ozřejmění přítomnosti amplikonů. K tomu slouží buď
elektroforéza,
nebo (nyní málo užívaná) hybridizacace
amplikonů v mikrotitrační destičce. Amplikony lze prokazovat a analyzovat také
genovými čipy.
- U tzv. real-time PCR (kinetické PCR)
průkaz amplikonů odpadá, metoda umožňuje průkaz amplikonů přímo v
cycleru. Zvyšující se fluorescence během amplifikace již je důkazem přítomnosti
hledaného agens a měřítkem jeho množství. Real-time PCR probíhá v tzv.
světelném cycleru.
Poznámky:
- Multiplex PCR je vlastně několik samostatných PCR průkazů prováděných souběžně
v jedné kyvetě. Kolik je hledaných původců, tolik je dvojic primerů.
- Ve světelném cycleru lze později zkoumat i průběh
denaturace získaných amplikonů zvyšující se teplotou a tím určit důležitou
charakteristiku amplikonů - bod tání (melting point). Ten závisí na
mutacích vyvolavatele a má význam při typizaci
vyvolavatele.
- Limitujícím faktorem rozvoje rutinních genetických metod v diagnostické mikrobiologii
jsou u nás i ve světě náklady na provedené vyšetření. Ty jsou nyní řádově
desetinásobkem ceny kultivačního vyšetření. Genetické metody se tak
uplatňují přednostně tam, kde kultivační průkaz je obtížný nebo nemožný.
Často se používají reakční směsi sestavené v laboratoři z jednotlivých
složek.
- Jsou i jiné amplifikační metody s omezeným významem - LCR, NASBA, SDA
a j.
- Pro detekci RNA lze PCR využit až po předchozím
zkopírování na DNA reverzní transkripcí.
|
|
Animované schéma PCR.
Primery vymezují vybraný specifický úsek DNA vhodný pro diagnostiku a jsou pro každého hledaného původce jiné.
Mají unikátní sekvenci bazí na prokazovaném úseku DNA - odlišná DNA se proto
amplifikovat nemůže. Polymeráza umožňující syntézu amplikonů je termostabilní
enzym, není denaturována při teplotě 93ºC
během denaturační fáze cyklu. Ovládací tlačítka vypnuta.
Copyright © 2000 The Royal Veterinary College University of London, Prof. Peter Chantler.
|
|
|
Cykler (cyklátor) je zvláštní inkubátor,
ve kterém PCR probíhá. Cykler podle programu periodicky mění teplotu v kyvetách. Pro
rychlý přestup tepla se dodávají speciální tenkostěnné event. žebrované kyvety, nebo (u light cycleru Roche) speciální skleněné kapiláry. Cyklerů je mnoho různých typů. Na ukázce je starší typ cykleru, do kterého je vkládán rámeček s naplněnými
kyvetami. Vyhřívací blok cykleru k nim po dotažení víka těsně přilehne.Víko
je vyhřívané, aby nedocházelo ke kondenzaci reakční směsi na víčkách. |
Kontrola procesu při PCR
U PCR je nutno vyloučit falešně negativní i falešně
pozitivní výsledek vyšetření.
- Falešně negativní výsledek někdy nastává
např. za přítomnosti inhibitorů polymerázy (talek, heparin, močovina, složky hnisu).
Falešně nagativní výsledek se vyloučí souběžnou amplifikací syntetického oligonukleotidu přidaného
ke vzorku (interní kontrola). Nedojde-li k jeho amplifikaci, jde o selhání
reakce.
- Falešně pozitivní výsledek nastává vzdušnou kontaminací dosud
nevyšetřeného vzorku amplikony při neopatrném pipetování jiného pozitivního
již amplifikovaného vzorku. Vzdušné kontaminaci se předchází stavebním oddělením
jednotlivých úseků laboratoře, používáním boxů s bariérou laminárního
proudu vzduchu anebo preventivním ošetřením vzorků uracil n glykosylázou ničící
amplikony, ne však přírodní NK (master mix v tom případě obsahuje uracil
místo thyminu a získavané amplikony se tak liší od přírodní DNA - systém
AmpErase). U real-time PCR se kyvety pro amplifikaci vůbec neotevírají,
ale rovnou vyhazují a tak je zde toto riziko nepoměrně menší.
|
|