Quantiferon®

Osoby, které přišly do kontaktu s infekčním agens mají v důsledku proběhlé imunitní odpovědi v krvi specifické T-lymfocyty schopné reagovat s antigeny tohoto infekčního agens. Jestliže do krve odebrané takové osobě přidáme antigeny tohoto agens a inkubujeme ji při teplotě 37°C, dojde k rychlé aktivaci specifických T-lymfocytů, které pak produkují interferon-gama (IFN-γ). Naproti tomu v krvi neimunní osoby se interferon během inkubace uvolňovat nebude. Zjištění produkovaného IFN-γ v krvi po její inkubaci s antigenem je tak známkou specifické imunitní odpovědi osoby na příslušného původce.  

Základem technologie QuantiFERON jsou dva kroky: 1) stimulace efektorových buněk v odebraném vzorku krve specifickým antigenem infekčního původce ve zkumavce a 2) následné měření koncentrace produkovaného IFN-γ v plazmě této krve metodou ELISA.  Souběžně se další dva vzorky krve téhož pacienta inkubují s mitogenem (fytohemaglutininem) - pozitivní kontrola, kde interferon se u jinak zdravých osob tvoří vždy, a bez antigenu (negativní kontrola). Porovnáním zjištěných koncentrací uvolněného IFN-γ v těchto třech měřených vzorcích se stanoví specifická reaktivita vyšetřované osoby na původce. Technologie se zatím využívá pro nepřímou diagnostiku tuberkulózní infekce. Díky vhodně zvoleným antigenům je zde reakce pozitivní jen u osob s tuberkulózní infekcí, ne u očkovaných. Kromě toho se technologie začíná používat ke stanovení rizika cytomegalovirózy po transplantaci ledvin a plic pocházejících od cytomegalovirus-pozitivních dárců stanovením odpovídavosti lymfocytů příjemce na cytomegalovirus. (K rutinní diagnostice probíhající cytomegalovirové nákazy se hodí spíše serologické vyšetření a PCR).  Výrobce dodává i soupravy, do kterých si uživatel sám přidá antigen libovolného jiného původce, kterého chce touto metodou prokazovat.         

Níže uvedené záběry a snímky pocházejí převážně od výrobce - firmy Cellestis, silně kráceno. Pro pochopení druhé fáze reakce (stanovení interferonu) je vhodné prostudovat metodu ELISA .  

ikona Krev se odebírá do 3 speciálních zkumavek s propichovacím víčkem (systém Vacutainer). Zkumavky se liší barvou víčka o neosahují buď žádný antigen (nil- kontrola), nebo mikrobiální antigen nebo mitogen.     ikona
ikona Po odběru je důležité zkumavkami třepat, aby se uvolnil antigen ze stěn zkumavek a mohlo dojít k imunitní reakci lymfocytů. Inkubace krve probíhá při teplotě 37°C 16-24 hodin.   ikona
ikona Po inkubaci se od krve oddělí plazma obsahující uvolněný IFN-γ. Plazma se dá do čistých zkumavek. V plazmě se nyní bude metodou ELISA měřit koncentrace IFN-γ (viz druhá tabulka níže). ikona

Schéma znázorňující uvolňování IFN-γ u osoby s pozitivní specifickou imunitní odpovědí na příslušného původce. APC - antigen-prezentující buňka. 

ikona 

ikona Lahvička přidaná k soupravě ELISA obsahuje odměřené množství IFN-γ. Slouží k přípravě standardů, které budou vyšetřovány souběžně se vzorky plazmy od pacientů. Porovnáním optické denzity v jamkách se standardy a v jamkách s plazmou bude vypočtena koncentrace interferonu v jamkách s plazmou.  ikona
ikona Jamky v destičce již obsahují protilátku proti IFN-γ pevně vázanou na plastu. Do jamek destičky se pipetují buď trojice vzorků plazmy nebo standardy. Je přítomen i  konjugát. Interferon se prostřednictvím protilátky váže na stěnu jamky, konjugát se váže na interferon. Konjugát je tak vázán ke stěně jamky.  ikona
ikona Jamky se promyjí a vše nanavázené na stěnu se odstraní. Přidá se substrát pro enzymatickou barevnou reakci, jejíž intenzita závisí na množství na stěně zachyceného interferonu.  ikona
ikona Barevná reakce se zastaví přidáním H2SO4. Fotometrem se změří optická denzita v jamkách.  ikona
ikona Výpočet výsledku vyšetření - zde demonstrován software pro cytomegalovirus. U TBC je postup stejný. Naměřené hodnoty optické denzity (OD) se přenesou do programu pro výpočet koncentrace interferonu v jamkách a pro interpretaci výsledku vyšetření. Zde bylo vyšetřeno 8 pacientů na buněčnou imunitu proti cytomegaloviru. U jednotlivých pacientů: N - nil, C - cytomegalovirový antigen, M - mitogen. Standardy: S1-S4. Program přepočte optické denzity na koncentrace IFN-γ.  

Interpretace vyšetření na buněčnou imunitu proti cytomegaloviru je  "reaktivní"-"neurčitý"-"negativní". Nejčastější příčinou neurčitých výsledků při metodě quantiferon, ať už u cytomegaloviru nebo u tuberkulózní infekce, je  špatně provedený odběr krve (málo se zkumavkou třepali). O řádek níže jsou uvedena interpretační kritéria pro vyšetření na tuberkulózní infekci. 

 ikona
ikona Algoritmus interpretace výsledku vyšetření na tuberkulózní infekci soupravou Quantiferon TB. Výsledek nezávisí na absolutních hodnotách koncentrace uvolněného IFN-γ, ale na vzájemném vztahu jeho koncentrací ve všech třech zkumavkách. "Pozitivní" - aktivní onemocnění pravděpodobné. "Negativní" - aktivní onemocnění nepravděpodobné. ikona