Zpětná aglutinace

V rámci druhů lze jednotlivé kmeny dále (poddruhově) třídit podle jejich povrchových antigenních determinat na tzv. sérotypy (sérovary - synonymum). Provádí se pomocí specifických komerčně vyráběných zvířecích sér na mikroskopickém podložním sklíčku. Pozitivní výsledek (shoda sérotypu kmene s příslušným sérem) se projeví vznikem aglutinátu. Pro lepší viditelnost se sklíčko prohlíží proti černému pozadí.

Nejčastěji se provádí u salmonel. Salmonely se podle Kauffmann-Whiteova schématu dělí tč. na 2 501 sérotypů. Každý sérotyp má jedinečnou kombinaci antigenních determinant polysacharidových tělových (O) a proteinových bičíkových (H) antigenů. Diagnostická laboratoř tyto antigenní znaky určuje u každého zachyceného kmene salmonely. Provádí to pomocí zakoupených diagnostických sér obsahujících protilátky proti jednotlivým antigenním determinantám. Séra jsou získávána z krve králíků imunizovaných příslušnými antigeny. Sérovary jsou pro přehlednost členěny do skupin A-Z.

Z praktických důvodů (pro zrychlení postupu) se při určování sérotypu neznámého kmene použijí nejdřív směsná séra OMA až OMG sloužící k předběžnému zatřídění kmene. (Např. sérum OMA aglutinuje salmonely skupin A, B, D, E, L. ) Po předběžném zatřídění mikrobiolog zahájí detailní identifikaci kmene pomocí příslušných sér monovalentních (obsahujících protilátky proti několika často souvisejícím antigenním determinantám), případně i sér faktorových - proti jednotlivým determinantám. Napřed se určují determinanty O antigenu, potom H antigenu.

Protože mikrobiolog ví, který sérotyp je v daném místě nejčastější (v ČR nyní Salmonella Enteritidis - přes 95% všech klinických izolátů), směřuje výběr sér napřed k tomuto sérotypu. V případě neúspěchu okruh pátrání rozšiřuje. Nelze tak napsat jednotný úsporný návod - smyslem postupu je nejkratší cesta k cíli. Předběžným předpokladem úspěšného určení sérotypu je jistota, že jde o salmonelu (kmen musí mít příslušné kultivační a biochemické vlastnosti).

Příklad

Mikrobiolog zjistí, že jím určovaný kmen salmonely je aglutinován směsným sérem OMA, ne OMB. Směsné sérum OMA obsahuje protilátky proti determinantám 1, 2, 3, 4, 5, 9, 10, 12, 15, 19, 21 O antigenu salmonel. K podrobnějšímu zkoumání kmene má mikrobiolog k dispozici osm monovalentních sér:

1, 2, 12
4, 5, 12
9, 12
9, 46
3, 10
3, 15
1, 3, 19
21

Zakoupil i protilátky proti některým determinantám - faktorová séra.

Mikrobiolog by nyní mohl zkoušet aglutinovat uvedený kmen systematicky všemi osmi výše uvedenými monovalentními séry. Ví ale, že nejpravděpodobněji půjde o Salmonella Enteritidis, která má O-antigen 1, 9, 12 a H-antigen g, m. Zkusí tedy napřed jen monovalentní sérum 9, 12 případně faktorové sérum 9.

Pokud je výsledek pozitivní, kmen by z hlediska O-antigenu mohl být Salmonella Enteritidis. To je nutno potvrdit stanovením determinanty g, m H antigenu kmene, protože O antigen 9, 12 má nejen Salmonella Enteritidis, ale i Salmonella Panama (má O-antigen 1, 9, 12 a H-antigen l, v), Salmonella Dublin (má O-antigen 1, 9, 12 a H-antigen g, p), dokonce i Salmonella Typhi (má O-antigen 9, 12 a H-antigen d a navíc Vi antigen). Postup určení H-antigenu je analogický, jako u O-antigenu.

U některých sérotypů salmonel a vůbec enterobakterií se analogicky určují ještě H-antigeny "druhé fáze" - označují se číslicemi. Vyskytují se souběžně s antigeny první fáze, jindy je nutno vyprovokovat jejich tvorbu protilátkou proti tvořenému antigenu opačné fáze. Jde o přepínání genů.

Při podezření na Salmonella Typhi nebo Salmonella Paratyphi C se příslušným sérem prokazuje ještě antigen Vi.

Praktické provedení:

		Aglutinační séra prodává řada výrobců.
		Pracovní plocha připravená k testování kmene salmonely.
		Čistá kultura zkoumaného kmene salmonely se uchovává na šikmém agaru. Z čisté kultury se kličkou připraví suspenze ve fyziologickém roztoku.
		Na čisté podložní sklíčko se kápne příslušné aglutinační sérum. Na jednom sklíčku lze provést souběžně aglutinace se 2 - 3 různými séry.
		Kličkou se přenese několik kliček suspenze kmene do blízkosti kapky séra. Pak se kličkou sérum a suspenze smísí. Kývavými pohyby sklíčka se docílí proudění potřebné k navázání protilátek a shluknutí bakterií.
		Protilátky spojily jednotlivé bakteriální buňky do viditelných shluků: Došlo k aglutinaci, průkaz antigenu je pozitivní. Poté se sklíčko vloží do nádobky s dezinfekčním roztokem.

Běžná laboratoř má jen aglutinační séra pro běžně se vyskytující sérotypy. Pokud se nepodaří kmen aglutinovat těmito základními séry, kmen se zasílá k určení do Národní referenční laboratoře.

Historické názvosloví salmonel ztratilo své biologické opodstatnění, ale z praktických důvodů se připouští. Původní názvosloví se uplatnilo v názvech sérotypů. Např. Salmonella typhimurium je nyní Salmonella enterica subsp. enterica ser. Typhimurium. Může se ale psát i Salmonella serotyp Typhimurium, Salmonella Typhimurium nebo S. Typhimurium (pozor na správný řez písma a na velké písmeno na začátku).

Skupiny A-Z jsou charakteristické určitou determinantou O antigenu. Někdy se přímo říká O skupiny. Kromě toho se mohou u příslušníků skupiny vyskytovat i jiné determinaty O antigenu - ty již zařazení do skupiny neovlivňují. Např. všechny salmonely skupiny B mají ve svém O antigenu determinantu 4. Salmonella Brandengurg nebo Salmonella Agona mají O-antigen 1,4,12 - proto patří do skupiny B. Všechny salmonely skupiny D mají O determinantu 9 atd. V tabulce jsou pro ilustraci uvedeny sérotypy skupiny D:

sérotyp	O	H
sérotyp	O	1.fáze	2.fáze
Dublin	1,9,12 [Vi]	g,p	1,5
Enteritidis	1,9,12	g,p	-
Typhi	9,12 [Vi]	d	-
Gallinarum	1,9,12	-
Panama	1,9,12	l,v

Označení směsných sér skupinu nevyjadřuje, není zde souvislost. Sérum OMA aglutinuje sérotypy skupin A, B, D, E, L, sérum OMB aglutinuje skupiny C, F, G, H atd.